Es la pesadilla de cualquier técnico de laboratorio: terminas tu ensayo de 5 horas, añades la solución de parada y… todo se pone amarillo. Incluso los pocillos blancos (blanks) tienen color.
Tener un Fondo Alto (High Background) significa que la Densidad Óptica (OD) de tus controles negativos es demasiado alta, lo que hace imposible distinguir la señal real de tus muestras de baja concentración. Básicamente, el «ruido» tapa la «música».
En Kit-Elisa.es, recibimos muchas consultas sobre esto. Por suerte, el 90% de las veces se debe a uno de estos 5 errores comunes que tienen fácil solución.
1. Lavado Insuficiente (La causa)
Si tuviera que apostar, diría que el problema está aquí. El lavado sirve para eliminar todo lo que no se ha unido específicamente. Si queda algún resto de anticuerpo conjugado «flotando» o pegado débilmente, dará señal de color.
- El Problema: Pocos ciclos de lavado, volumen insuficiente por pocillo o lavadora automática con agujas obstruidas.
- La Solución:
- Aumenta el número de lavados (de 3 a 5 o 6 veces).
- Asegúrate de llenar el pocillo hasta arriba (300-350 µL) pero sin que rebose (cross-contamination).
- Incluye un paso de «Soak» (Remojo): deja el buffer de lavado en el pocillo durante 30-60 segundos antes de aspirar. Esto hace maravillas.
2. Bloqueo Ineficaz (Blocking)
Después de tapizar la placa, quedan huecos libres de plástico. Si no los cubres (bloqueas), los anticuerpos de detección se pegarán ahí de forma inespecífica.
- El Problema: La proteína de bloqueo no es la adecuada o su concentración es baja.
- La Solución:
- Revisa si estás usando BSA (Albúmina) o Leche Desnatada. A veces, cambiar de una a otra soluciona el problema.
- Aumenta la concentración del bloqueante (del 1% al 3% o 5%).
- Alarga el tiempo de incubación del bloqueo.
- Nota: Nuestros Kits ELISA comerciales ya vienen pre-bloqueados para evitarte este dolor de cabeza.
3. Concentración excesiva del Anticuerpo de Detección
En ELISA, «más» no siempre es «mejor». Si añades demasiado anticuerpo secundario conjugado (HRP), este se pegará a cualquier cosa por saturación.
- El Problema: Usar una dilución incorrecta (ej. 1:1000 cuando debería ser 1:10.000).
- La Solución:
- Haz una titulación (Checkboard titration) para encontrar la dilución óptima.
- Sigue estrictamente las instrucciones del manual del kit. No improvises las diluciones.
4. Contaminación del Sustrato (TMB)
El TMB es muy sensible. Si se oxida antes de tiempo, se vuelve azul por sí solo.
- El Problema: El TMB estaba azul antes de ponerlo en la placa, o usaste una punta de pipeta sucia (con restos de HRP) para cogerlo del bote.
- La Solución:
- Mira el bote de TMB a contraluz. Debe ser transparente. Si tiene un tono azulado o verdoso, tíralo y usa uno nuevo.
- Nunca devuelvas el sobrante de TMB al bote original.
- Usa siempre puntas nuevas y estériles.
5. Incubación excesiva (Tiempo y Temperatura)
Las reacciones químicas se aceleran con el calor.
- El Problema: Dejaste la placa incubando toda la noche a temperatura ambiente cuando era a 4ºC, o dejaste el sustrato reaccionando 30 minutos cuando eran 15.
- La Solución:
- Controla el tiempo con cronómetro.
- Si el manual dice incubar a 37ºC, asegúrate de que tu estufa no está a 39ºC.
- Vigila el desarrollo de color del sustrato. Si los estándares altos se ponen azul oscuro muy rápido, para la reacción antes.
Resumen: Cómo salvar tu próximo ELISA
Si tienes fondo alto, la próxima vez prueba esto en orden:
- Añade un paso de remojo (soak) de 1 minuto en los lavados.
- Lava 2 veces extra.
- Diluye más el anticuerpo conjugado.
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